2013-06-14
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液(ye)(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)以經典(dian)的(de)(de)(de)(de)(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)為(wei)基礎(chu)，是以高壓下的(de)(de)(de)(de)(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)體為(wei)流動相(xiang)(xiang)(xiang)的(de)(de)(de)(de)(de)色(se)(se)(se)譜(pu)過程。通常(chang)所(suo)說的(de)(de)(de)(de)(de)柱(zhu)層(ceng)(ceng)(ceng)析、薄層(ceng)(ceng)(ceng)層(ceng)(ceng)(ceng)析或紙層(ceng)(ceng)(ceng)析就是經典(dian)的(de)(de)(de)(de)(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)。所(suo)用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)固定相(xiang)(xiang)(xiang)為(wei)大于100um的(de)(de)(de)(de)(de)吸附劑(ji)(ji)（硅膠、氧化鋁等(deng)）。這種傳統(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)液(ye)(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)所(suo)用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)固定相(xiang)(xiang)(xiang)粒(li)度大，傳質(zhi)擴(kuo)散慢，因而柱(zhu)效低(di)，分離(li)能(neng)力差，只能(neng)進行(xing)簡單混合(he)物(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)分離(li)。而液(ye)(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)(xiang)所(suo)用(yong)的(de)(de)(de)(de)(de)固定相(xiang)(xiang)(xiang)粒(li)度小（5um-10um）、傳質(zhi)快、柱(zhu)效高。液(ye)(ye)(ye)(ye)相(xiang)(xiang)(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)法（HPLC）是20世紀60年代后期發展起來(lai)(lai)的(de)(de)(de)(de)(de)一種分析方法。近年來(lai)(lai)，在保健食品功效成分、營(ying)養強化劑(ji)(ji)、維生(sheng)素類、蛋白(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)(de)分離(li)測定等(deng)應用(yong)廣(guang)泛。世界(jie)上約有(you)80%的(de)(de)(de)(de)(de)有(you)機(ji)化合(he)物(wu)可以用(yong)HPLC來(lai)(lai)分析測定。
液相色譜(pu)分(fen)析原理（一(yi)）液相色譜(pu)分(fen)析的(de)流(liu)程由(you)泵將儲液瓶中的(de)溶劑吸(xi)入(ru)(ru)色譜(pu)系統，然后輸出(chu)，經流(liu)量(liang)與(yu)壓力測(ce)量(liang)之后，導入(ru)(ru)進樣器(qi)。被測(ce)物由(you)進樣器(qi)注入(ru)(ru)，并(bing)隨流(liu)動相通過色譜(pu)柱，在柱上進行分(fen)離(li)后進入(ru)(ru)檢測(ce)器(qi)，檢測(ce)信號由(you)數據(ju)處理設(she)備采集與(yu)處理，并(bing)記錄(lu)色譜(pu)圖。廢(fei)液流(liu)入(ru)(ru)廢(fei)液瓶。遇到復雜的(de)混合物分(fen)離(li)（極性范圍比較寬）還可用梯度(du)控制器(qi)作梯度(du)洗脫(tuo)。這(zhe)和氣(qi)相色譜(pu)的(de)程序升溫類(lei)似(si)，不同的(de)是(shi)氣(qi)相色譜(pu)改(gai)變(bian)溫度(du)，而HPLC改(gai)變(bian)的(de)是(shi)流(liu)動相極性，使(shi)樣品(pin)各組分(fen)在*條件下得以分(fen)離(li)。
（二）液(ye)相(xiang)(xiang)色(se)(se)譜的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)過程(cheng)同其他色(se)(se)譜過程(cheng)一樣(yang)，HPLC也是溶(rong)質(zhi)在(zai)固(gu)定(ding)(ding)相(xiang)(xiang)和(he)(he)流(liu)(liu)動(dong)相(xiang)(xiang)之間(jian)進(jin)行的(de)(de)一種(zhong)連續多(duo)次交換過程(cheng)。它借溶(rong)質(zhi)在(zai)兩相(xiang)(xiang)間(jian)分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)系(xi)數(shu)、親(qin)和(he)(he)力、吸附力或分(fen)(fen)(fen)(fen)子大小(xiao)不同而(er)引起的(de)(de)排阻作用的(de)(de)差別使不同溶(rong)質(zhi)得以分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)。開始樣(yang)品加(jia)在(zai)柱(zhu)(zhu)頭(tou)上，假設樣(yang)品中(zhong)含(han)(han)有3個組(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)，A、B和(he)(he)C，隨流(liu)(liu)動(dong)相(xiang)(xiang)一起進(jin)入色(se)(se)譜柱(zhu)(zhu)，開始在(zai)固(gu)定(ding)(ding)相(xiang)(xiang)和(he)(he)流(liu)(liu)動(dong)相(xiang)(xiang)之間(jian)進(jin)行分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)。分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)系(xi)數(shu)小(xiao)的(de)(de)組(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)A不易被固(gu)定(ding)(ding)相(xiang)(xiang)阻留，較早地流(liu)(liu)出色(se)(se)譜柱(zhu)(zhu)。分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)系(xi)數(shu)大的(de)(de)組(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)C在(zai)固(gu)定(ding)(ding)相(xiang)(xiang)上滯留時間(jian)長，較晚流(liu)(liu)出色(se)(se)譜柱(zhu)(zhu)。組(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)B的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)系(xi)數(shu)介于A，C之間(jian)，第二個流(liu)(liu)出色(se)(se)譜柱(zhu)(zhu)。若一個含(han)(han)有多(duo)個組(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)的(de)(de)混合物進(jin)入系(xi)統，則混合物中(zhong)各組(zu)分(fen)(fen)(fen)(fen)按其在(zai)兩相(xiang)(xiang)間(jian)分(fen)(fen)(fen)(fen)配(pei)系(xi)數(shu)的(de)(de)不同先(xian)后流(liu)(liu)出色(se)(se)譜柱(zhu)(zhu)，達(da)到分(fen)(fen)(fen)(fen)離(li)之目的(de)(de)。
不同(tong)組(zu)分(fen)(fen)(fen)在色(se)譜過程中的(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)離(li)情況(kuang)(kuang)，首先取決于各組(zu)分(fen)(fen)(fen)在兩(liang)相(xiang)(xiang)間(jian)的(de)(de)(de)分(fen)(fen)(fen)配系數(shu)、吸附能(neng)力(li)(li)、親和力(li)(li)等是否有差異，這是熱力(li)(li)學(xue)(xue)(xue)平衡問題，也是分(fen)(fen)(fen)離(li)的(de)(de)(de)首要(yao)條(tiao)件。其次，當不同(tong)組(zu)分(fen)(fen)(fen)在色(se)譜柱(zhu)中運動(dong)時，譜帶隨柱(zhu)長展寬，分(fen)(fen)(fen)離(li)情況(kuang)(kuang)與(yu)兩(liang)相(xiang)(xiang)之(zhi)間(jian)的(de)(de)(de)擴散系數(shu)、固定相(xiang)(xiang)粒度的(de)(de)(de)大(da)小、柱(zhu)的(de)(de)(de)填充情況(kuang)(kuang)以及流(liu)(liu)動(dong)相(xiang)(xiang)的(de)(de)(de)流(liu)(liu)速(su)等有關。所以分(fen)(fen)(fen)離(li)zui終效果則(ze)是熱力(li)(li)學(xue)(xue)(xue)與(yu)動(dong)力(li)(li)學(xue)(xue)(xue)兩(liang)方面(mian)的(de)(de)(de)綜合效益(yi)。
液(ye)相(xiang)色(se)(se)(se)譜(pu)的類(lei)型(xing)（一）吸(xi)附(fu)色(se)(se)(se)譜(pu)在(zai)吸(xi)附(fu)色(se)(se)(se)譜(pu)中(zhong)，樣品的極性(xing)官能(neng)(neng)團牢固(gu)地保留在(zai)填料的吸(xi)附(fu)活性(xing)中(zhong)心上，非極性(xing)烴基(ji)幾(ji)乎不(bu)(bu)予保留。所以，要清楚地辨別極性(xing)功能(neng)(neng)團的種(zhong)類(lei)、數量和(he)位置。通常，樣品能(neng)(neng)用吸(xi)附(fu)色(se)(se)(se)譜(pu)分(fen)離的應是能(neng)(neng)溶(rong)解于(yu)有機溶(rong)劑并(bing)是非離子型(xing)的，強(qiang)離子樣品是不(bu)(bu)適宜的。
吸(xi)(xi)附(fu)色譜(pu)所使(shi)用的流動相以正己烷、三氯甲烷、二氯甲烷作為基礎，按照(zhao)樣品的極性加(jia)上乙醇，然而，是使(shi)所加(jia)入(ru)醇的濃度為10%或更少一些。如有可能(neng)(neng)，可進一步減(jian)小百(bai)分數。因為高(gao)濃度的醇會減(jian)少填料的吸(xi)(xi)附(fu)活性，減(jian)弱吸(xi)(xi)附(fu)能(neng)(neng)力，并使(shi)重現困(kun)難。
（二）分(fen)配(pei)色(se)譜1.正(zheng)(zheng)相分(fen)配(pei)色(se)譜正(zheng)(zheng)相分(fen)配(pei)色(se)譜適(shi)用于(yu)不(bu)溶于(yu)水而溶于(yu)有機溶劑且帶(dai)有極(ji)性基團的樣(yang)品，但(dan)正(zheng)(zheng)相分(fen)配(pei)色(se)譜不(bu)適(shi)合于(yu)離(li)子型物(wu)質。
2.反相分配色譜(pu)這種(zhong)方法目前應用非常廣泛，應用的范圍也很廣，在反相分配色譜(pu)中，樣(yang)品的非極性部分起保留(liu)作用。
通(tong)過使用(yong)的(de)流(liu)動(dong)相(xiang)是(shi)水(shui)—甲(jia)醇(chun)和水(shui)—乙腈，通(tong)過加(jia)入甲(jia)醇(chun)或(huo)乙腈的(de)量的(de)不同來調節(jie)分離(li)(li)，但(dan)如(ru)果樣品(pin)(pin)帶有(you)離(li)(li)子(zi)型基(ji)團(tuan)，需(xu)要在流(liu)動(dong)相(xiang)中(zhong)加(jia)入鹽(yan)或(huo)調節(jie)流(liu)動(dong)相(xiang)的(de)PH值(zhi)，例如(ru)，如(ru)果樣品(pin)(pin)有(you)一個—COOH基(ji)團(tuan)，使流(liu)動(dong)相(xiang)的(de)PH值(zhi)是(shi)偏向酸性的(de)，由于抑(yi)制(zhi)了(le)—COOH基(ji)團(tuan)的(de)電離(li)(li)而加(jia)強了(le)保留。這個方法叫離(li)(li)子(zi)抑(yi)止(zhi)法，如(ru)果樣品(pin)(pin)有(you)強離(li)(li)子(zi)基(ji)，有(you)時(shi)候采(cai)用(yong)在流(liu)動(dong)相(xiang)中(zhong)加(jia)入適當抗衡離(li)(li)子(zi)以形成離(li)(li)子(zi)對的(de)離(li)(li)子(zi)對法。
在調節PH值(zhi)中，保持PH值(zhi)在填料說明(ming)書手(shou)冊(ce)中所(suo)規定(ding)的(de)范圍內，大多(duo)數化(hua)(hua)學鍵(jian)式的(de)二氧化(hua)(hua)硅使用在PH=2-9，然而(er)，當加入鹽(yan)以后，使其PH=7.5-8或更小的(de)，多(duo)孔聚合物填料能應用非常(chang)廣泛的(de)PH值(zhi)。
（三）離(li)子(zi)(zi)(zi)交換(huan)(huan)色譜這個方(fang)法是用(yong)填料的(de)(de)固定相的(de)(de)離(li)子(zi)(zi)(zi)交換(huan)(huan)基(ji)團(tuan)和樣品(pin)的(de)(de)離(li)子(zi)(zi)(zi)基(ji)團(tuan)之間的(de)(de)離(li)子(zi)(zi)(zi)交換(huan)(huan)來(lai)分(fen)(fen)離(li)樣品(pin)組分(fen)(fen)的(de)(de)，按照所交換(huan)(huan)的(de)(de)離(li)子(zi)(zi)(zi)分(fen)(fen)成(cheng)陽離(li)子(zi)(zi)(zi)交換(huan)(huan)和陰離(li)子(zi)(zi)(zi)交換(huan)(huan)。
離(li)子交(jiao)換色譜(pu)使(shi)用(yong)于能(neng)溶于水的(de)(de)離(li)子型物(wu)質。在離(li)子交(jiao)換色譜(pu)中(zhong)，流(liu)動相(xiang)(xiang)的(de)(de)鹽(yan)(yan)的(de)(de)濃(nong)度、PH及鹽(yan)(yan)的(de)(de)種類等都對保留(liu)值有很(hen)大(da)的(de)(de)影響。在液(ye)相(xiang)(xiang)色譜(pu)的(de)(de)離(li)子交(jiao)換中(zhong)所用(yong)的(de)(de)鹽(yan)(yan)有磷酸(suan)鹽(yan)(yan)、醋(cu)酸(suan)鹽(yan)(yan)和硼(peng)酸(suan)鹽(yan)(yan)。因(yin)為氯化物(wu)會腐(fu)蝕不(bu)銹鋼儀器，在液(ye)相(xiang)(xiang)色譜(pu)中(zhong)不(bu)能(neng)使(shi)用(yong)NaCI或其(qi)他的(de)(de)氯化物(wu)鹽(yan)(yan)類。根據測量波長有些(xie)鹽(yan)(yan)也不(bu)能(neng)使(shi)用(yong)，例(li)如，醋(cu)酸(suan)吸收(shou)大(da)約在210nm，當檢測處(chu)在短(duan)波端的(de)(de)時候，用(yong)醋(cu)酸(suan)作流(liu)動相(xiang)(xiang)是不(bu)合適(shi)的(de)(de)。
（四）凝膠色(se)譜(pu)凝膠色(se)譜(pu)不同于以上(shang)三種分(fen)(fen)離方法。凝膠色(se)譜(pu)是根據分(fen)(fen)子大(da)小用(yong)分(fen)(fen)子篩(shai)效應來(lai)分(fen)(fen)離樣(yang)品組分(fen)(fen)的。這(zhe)個方法也叫排(pai)阻色(se)譜(pu)或粒度(du)排(pai)阻色(se)譜(pu)。具有一定孔徑的多(duo)孔性合成聚合物經常用(yong)作(zuo)填(tian)料。
因為在樣品中，小尺(chi)(chi)寸的(de)(de)分子深深地(di)滲(shen)透到(dao)微(wei)孔中，所以遲流(liu)出(chu)，而大尺(chi)(chi)寸的(de)(de)分子沒有滲(shen)透到(dao)微(wei)孔中，就很(hen)快流(liu)出(chu)。通(tong)常(chang)合(he)成樹脂的(de)(de)分離使用有機溶劑作流(liu)動相，叫做凝膠(jiao)滲(shen)透色譜(pu)。
凝(ning)(ning)膠色譜依樣(yang)品的(de)性質(zhi)又可分為凝(ning)(ning)膠滲(shen)透(tou)和(he)凝(ning)(ning)膠過濾。
1.凝膠滲透色譜(pu)凝膠滲透色譜(pu)（GelPermeationChromatography），簡稱(cheng)GPC。此一類的色譜(pu)，使(shi)用(yong)于有機(ji)性溶(rong)媒(mei)的樣品中，如PVC，PS，ABS等等，而所用(yong)的洗脫(tuo)液有THF，Chloroform等等。
2.凝膠過濾(lv)色(se)譜(pu)(pu)凝膠過濾(lv)色(se)譜(pu)(pu)（GelFiltrarionChromatography），簡稱GFC。此(ci)一種類(lei)的層析法，使用于水(shui)溶媒的試劑中，如蛋白(bai)質、淀粉及水(shui)性合成高(gao)分子(zi)等等，而所(suo)用的溶液有水(shui)、緩沖液等等。
凝(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)的(de)(de)種類很多，按其(qi)原料(liao)來(lai)源(yuan)可(ke)分為(wei)有機膠(jiao)(jiao)(jiao)和無機膠(jiao)(jiao)(jiao)。按其(qi)制備的(de)(de)方法(fa)又(you)(you)(you)可(ke)分為(wei)均勻、半均勻和非均勻三種凝(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)。而根據凝(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)的(de)(de)強度又(you)(you)(you)可(ke)分為(wei)軟膠(jiao)(jiao)(jiao)、半硬(ying)膠(jiao)(jiao)(jiao)和硬(ying)膠(jiao)(jiao)(jiao)三大類。根據它對溶劑的(de)(de)適用范圍又(you)(you)(you)可(ke)分為(wei)親(qin)水性(xing)、親(qin)油性(xing)和兩(liang)性(xing)凝(ning)膠(jiao)(jiao)(jiao)等等。
附：液相(xiang)色(se)(se)(se)譜是(shi)目前應用(yong)zui多的色(se)(se)(se)譜分析方法，液相(xiang)色(se)(se)(se)譜系統(tong)由流動相(xiang)儲液體(ti)瓶、輸(shu)液泵、進(jin)樣(yang)器(qi)、色(se)(se)(se)譜柱(zhu)、檢測器(qi)和記錄器(qi)組成，其整體(ti)組成類似于氣相(xiang)色(se)(se)(se)譜，但是(shi)針(zhen)對其流動相(xiang)為液體(ti)的特點作(zuo)出很多調整。
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