動物性產品中獸藥殘留的快速檢測方法
2012/4/20
[7177]
動物性產品中獸藥殘(can)留(liu)的快速(su)檢測方(fang)法(fa)
—— ELISA & CharmⅡ
一、前言：
1、 現狀
目前獸醫用藥幾乎占據(ju)了所有抗(kang)微生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)藥物(wu)(wu)的(de)(de)50%，因此食品(pin)病(bing)原菌(jun)、條件致病(bing)菌(jun)和共生(sheng)(sheng)菌(jun)不可(ke)避免的(de)(de)成了耐藥菌(jun)。在過(guo)去的(de)(de)50年中大(da)約有100萬噸(dun)的(de)(de)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)被釋(shi)放到生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)圈(quan)中。歐洲動物(wu)(wu)衛生(sheng)(sheng)聯盟(meng)（European Federation of Animal Health ，FEDESA）對歐盟(meng)和瑞士抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)使用統計數(shu)據(ju)表明，僅(jin)1997年用于人類健(jian)康的(de)(de)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)達(da)5460噸(dun)，用于動物(wu)(wu)健(jian)康的(de)(de)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)達(da)3465噸(dun)，用于動物(wu)(wu)生(sheng)(sheng)長促進劑的(de)(de)抗(kang)生(sheng)(sheng)素(su)(su)達(da)1575噸(dun)，并有逐年增加的(de)(de)趨勢。
在我(wo)國，由于(yu)獸(shou)醫用藥(yao)制度的不完(wan)善及一些(xie)養殖廠受(shou)經濟利益的驅使(shi)及相(xiang)應(ying)的檢測監督體(ti)系不健全，藥(yao)物的濫用現象更為嚴重，動物產品中獸(shou)藥(yao)的污染時有發生(sheng)。其潛在的致癌、致畸作(zuo)用引起了社會(hui)的普遍(bian)關注，由于水(shui)產品中(zhong)(zhong)氯霉(mei)素含量過高，歐盟(meng)委員會于今年1月(yue)作出(chu)(chu)禁止中(zhong)(zhong)國動物源食品進口(kou)的協(xie)議(yi)，使得(de)我國水(shui)產品對(dui)歐盟(meng)出(chu)(chu)口(kou)嚴重受(shou)挫，雖然現在部分(fen)產品開(kai)始解禁，但形式(shi)依然不容樂(le)觀(guan)；美國、日本(ben)等國也開(kai)始高度關注我國水(shui)產品的質量，并出(chu)(chu)臺一系列相關政策，對(dui)我國出(chu)(chu)口(kou)動物性產品進行限制。在現(xian)代文明的(de)世界(jie)，健(jian)康*的(de)貿易(yi)(yi)法則將是(shi)關稅(shui)、價(jia)格(ge)、質量(liang)所不可比擬(ni)的(de)，政治(zhi)上的(de)友好往來無(wu)法替代經濟貿易(yi)(yi)中的(de)游戲規則。
2、食品中獸藥殘留對人類(lei)的危(wei)害
2.1耐藥菌株的產生
抗(kang)生(sheng)素(su)使用(yong)和細菌耐(nai)藥(yao)性永遠是(shi)互相依存(cun)、互相制約的(de)矛(mao)盾的(de)兩個方面(mian)，細菌耐(nai)藥(yao)非(fei)正常增(zeng)加，往(wang)往(wang)是(shi)抗(kang)生(sheng)素(su)的(de)非(fei)正常使用(yong)的(de)結果(guo)。早(zao)在1920-30年(nian)青霉素(su)問世時，Dr Fleming就提出了(le)青霉(mei)素的(de)耐(nai)藥(yao)(yao)性(xing)問題。隨著時代的(de)發(fa)展和各種(zhong)新藥(yao)(yao)的(de)出現，耐(nai)藥(yao)(yao)性(xing)菌株也接(jie)踵而至（即包括(kuo)藥(yao)(yao)物選擇壓力的(de)結(jie)果也包括(kuo)細菌自身的(de)進化）。抗生素的(de)副作(zuo)用(yong)以及耐藥菌株的(de)存在將嚴(yan)重威脅著人類的(de)健康，而且臨床(chuang)亞治(zhi)療水(shui)平的(de)抗(kang)生(sheng)素更(geng)容易促使(shi)抗(kang)性(xing)基(ji)因(yin)的(de)轉移(yi)(yi)，比如對動(dong)物進(jin)行低(di)水(shui)平四環素治(zhi)療，其糞腸菌(jun)群由對四環素敏感逐漸變成(cheng)抗(kang)四環素zui后發(fa)展成(cheng)對其它藥(yao)物也(ye)產生(sheng)抗(kang)性(xing)。在長期的(de)生(sheng)活中，恰(qia)恰(qia)是人類和(he)動(dong)物腸道(dao)的(de)正(zheng)常菌(jun)群成(cheng)了耐(nai)(nai)藥(yao)基(ji)因(yin)的(de)儲存庫，并不斷的(de)將耐(nai)(nai)藥(yao)基(ji)因(yin)轉移(yi)(yi)給致病(bing)菌(jun)，并在人和(he)動(dong)物中交叉傳播，尤(you)其是釋放到環境中耐(nai)(nai)藥(yao)菌(jun)的(de)危(wei)害更(geng)為嚴重，可造(zao)成(cheng)耐(nai)(nai)藥(yao)基(ji)因(yin)的(de)迅速轉移(yi)(yi)。
2.2抗生素的毒副(fu)作用
殘(can)留在動物性食(shi)(shi)品中的(de)(de)抗(kang)生(sheng)素(su)被(bei)人(ren)(ren)們食(shi)(shi)用后，除(chu)了加速人(ren)(ren)體內耐藥菌株的(de)(de)進化之外(wai)，抗(kang)生(sheng)素(su)本身的(de)(de)毒副(fu)作用往(wang)往(wang)威(wei)脅人(ren)(ren)類尤其是孕婦和嬰兒的(de)(de)健康，這一點在過去往(wang)往(wang)很容(rong)易(yi)被(bei)忽視。
2.2.1氯霉素
主要由Streptomyces venezuelae產生(sheng)，目前已能人(ren)工合成。它能抑制細菌蛋白質生(sheng)物合成，其效應(ying)部位位于核糖體上，因(yin)而對大多數G+菌和(he)G－菌(jun)都(dou)有殺傷(shang)力。氯(lv)(lv)霉(mei)(mei)素的(de)毒副作用(yong)(yong)較多(duo)，其常見的(de)是再生障(zhang)礙貧血、造血功能紊亂、灰嬰綜合征、肢體(ti)感覺和(he)運動障(zhang)礙及休克。雖然氯(lv)(lv)霉(mei)(mei)素在動物疾(ji)病防(fang)治上(shang)曾(ceng)發揮過(guo)一定的(de)作用(yong)(yong)，但由于氯(lv)(lv)霉(mei)(mei)素可以產(chan)生致命性的(de)副作用(yong)(yong)，因此歐盟已經在畜牧(mu)、水產(chan)業生產(chan)中(zhong)禁止使用(yong)(yong)。
2.2.2b－內(nei)酰胺(an)
b－內(nei)酰胺類抗生(sheng)素通過(guo)抑制細菌轉肽酶的(de)活(huo)性而干擾細胞壁(bi)肽聚糖的(de)合(he)成，安芐青(qing)霉素和青(qing)霉素G是該類zui常見的兩種化合物，由Penicillium chrysogenum產生(sheng)。它可以通(tong)過(guo)(guo)胎(tai)(tai)盤傳給胎(tai)(tai)兒(er)，也(ye)能通(tong)過(guo)(guo)乳腺進入乳中。zui常(chang)見(jian)的副(fu)作(zuo)用是以皮膚(fu)出現紅斑為主要癥(zheng)狀的過(guo)敏反應(ying)以及(ji)胃(wei)腸道紊亂(luan)引起的腹瀉、惡心(xin)和嘔吐。
2.2.3四環素
包括Oxytetracycline （土霉素，OTC）、tetracycline （四環素(su)，TC）、 chlortetracycline （金霉(mei)素，CTC） 和doxycycline （強力霉素，DC）等。
2.2.4 b－興奮劑(ji)
為擬交(jiao)感神經類藥(yao)物，該類興奮劑的受體(ti)為b2受(shou)體故得名。該類興奮劑(ji)可以(yi)促(cu)使肌(ji)(ji)肉骨骼肌(ji)(ji)血管(guan)壁擴(kuo)張、支氣(qi)管(guan)和子宮平(ping)滑肌(ji)(ji)松弛。因而在獸醫臨床上b2興奮(fen)劑(ji)被廣(guang)泛(fan)用作支氣管擴(kuo)張(zhang)藥和(he)子宮松(song)弛藥，同時(shi)也被非法用作動物營(ying)養再分配的(de)促生(sheng)長劑(ji)。副作用，如：焦躁、震(zhen)顫、過(guo)敏、神(shen)智不(bu)清(qing)、食欲不(bu)振、惡心和(he)嘔吐(tu)等以及心悸、高血壓、心律(lv)失常、心動過(guo)速等心血管癥狀，其中擬(ni)交感神(shen)經類物質在組(zu)織中的(de)溢出均可導(dao)致(zhi)組(zu)織壞死(si)。
2.2.5雌激素
是一種人工合成的非固醇類雌激素，主要用于治療婦科紊亂、乳房和前列腺惡性腫瘤，為一種致癌物質；在肝臟中代謝緩慢，zui終能隨尿和糞便排出。副作用包括：水腫、引起性欲沖動、改變月經周期、乳房異常發育、肝功能改變、胃腸道紊亂、衰竭、頭痛、皮膚紅斑、風疹。對于雄性動物來說，大劑量的雌激素可以增加血管栓塞的危險。此外，雌激素還能引起子宮內膜增生，使患子宮癌的頻率增加。大劑量使用雌激素還可以導致骨骼發育閉合，停止生長。也能促使生殖道變形，對于雄性動物能使精子變形以及嘔吐等。
2.2.6氨基甙(dai)類抗(kang)生(sheng)素
主要包括慶大(da)霉(mei)素、鏈(lian)霉(mei)素、新霉(mei)素、卡(ka)那霉(mei)素等，為(wei)以(yi)氨(an)基(ji)(ji)環(huan)醇和(he)(he)氨(an)基(ji)(ji)糖(tang)相連成核糖(tang)單(dan)位(wei)的多(duo)價陽離(li)子復(fu)合(he)(he)物。氨(an)基(ji)(ji)甙(dai)類(lei)通過(guo)與(yu)細(xi)菌核糖(tang)體不可(ke)逆結(jie)合(he)(he)而(er)(er)干擾細(xi)菌蛋(dan)白質的合(he)(he)成，進而(er)(er)導(dao)(dao)致(zhi)細(xi)胞膜塌陷。氨(an)基(ji)(ji)甙(dai)類(lei)藥物的主要副作用(yong)是對(dui)聽覺(jue)器官和(he)(he)腎的毒性、過(guo)敏反應以(yi)及(ji)對(dui)神經(jing)(jing)肌肉的影響。其中，慶大(da)霉(mei)素能引起肝(gan)功紊亂(luan)、外周和(he)(he)中樞(shu)神經(jing)(jing)炎(yan)（包括腦炎(yan)、呆滯(zhi)、抽搐(chu)）；鏈(lian)霉(mei)素能導(dao)(dao)致(zhi)神經(jing)(jing)紊亂(luan)，包括視覺(jue)神經(jing)(jing)炎(yan)和(he)(he)外周神經(jing)(jing)炎(yan)，以(yi)及(ji)嚴重的皮炎(yan)、過(guo)敏等超(chao)敏感反應。
二、獸藥殘留的快(kuai)速檢測方法
目前(qian)上對抗生素(su)和(he)激素(su)類藥物殘(can)留的檢(jian)(jian)測(ce)(ce)主要(yao)有(you)儀(yi)器分析(xi)法(fa)（包括HPLC和(he)GC-MS）和(he)生物學(xue)快速(su)檢(jian)(jian)測(ce)(ce)法(fa)（如：ELISA、RIA、CharmⅡ等）。其(qi)中，儀(yi)器分析(xi)法(fa)既要(yao)求儀(yi)器設備具(ju)有(you)相當高的精度，也(ye)要(yao)求技術人員具(ju)有(you)一定的操(cao)作(zuo)和(he)分析(xi)技能。作(zuo)為(wei)儀(yi)器分析(xi)法(fa)，其(qi)昂貴的價(jia)格和(he)軟件(jian)更(geng)新的緩慢(man)以(yi)及操(cao)作(zuo)上的煩瑣限(xian)制了(le)此(ci)法(fa)的推廣；但由于檢(jian)(jian)測(ce)(ce)的靈敏度可以(yi)達到ng水(shui)平，在一些國(guo)家大型實(shi)驗室(shi)里仍作(zuo)為(wei)檢(jian)(jian)驗的參考依據使用。而生物(wu)學(xue)快速檢測(ce)法由于其(qi)操作上的(de)簡(jian)便、快(kuai)(kuai)速以及達到(dao)ng水平的(de)靈(ling)敏度等(deng)優點(dian)，以成(cheng)為(wei)動(dong)物產品中(zhong)獸藥殘留檢測的(de)一種重要手段(duan)。尤(you)其(qi)是ELISA（酶聯(lian)免疫吸附試驗）和CharmⅡ，其(qi)操作上的(de)簡(jian)便、快(kuai)(kuai)速和強烈的(de)信噪比、達到(dao)ng水平的(de)靈(ling)敏度等(deng)優點(dian)，其(qi)缺(que)陷在(zai)于該法(fa)會出現假陽(yang)性結果，但做(zuo)為(wei)一種快(kuai)(kuai)速篩選方法(fa)備受技(ji)術(shu)人(ren)員的(de)青睞，在(zai)檢測部(bu)門(men)有著廣泛的(de)應用前(qian)景。
1、ELISA檢測
1.1 所需儀器設備
酶標(biao)儀：常用的有美國的bio-lab（百樂），Bio-Tex,芬(fen)蘭Labsystem等，價格在5萬人民幣左右；
氮氣吹干儀：美國(guo) Organomatic Associates，2萬左右；
洗板機（不一(yi)定(ding)要配置(zhi)）：與酶標儀(yi)相(xiang)應，價格(ge)在3-4萬(wan)人民幣左(zuo)右(you)；
離(li)心機：6000g/min，國產(chan)價(jia)格在5000左右；
均質器：德國(guo)IKA，人民(min)幣6000左右；（拍式均質器：1-2萬）
移液器：單道：1550/件，多道：5000/件；
恒溫培養箱：
固相(xiang)萃取儀：
1.2常用ELISA試劑盒
英國(guo)朗道（RANDOX），德(de)國(guo)拜發(fa)（r-Biopharm），德(de)國(guo)Riedel-deHaen，荷蘭(lan)E-D，美國NEOGEN，意大利(li)Tecna等。
1.3檢(jian)測原理(li)（競爭(zheng)法）
1.3.1 抗原抗體的基本結構
1.3.2檢測的基礎是基于抗原抗體的膠體特性與極性基的吸附作用。抗體的蛋白質（免疫球蛋白），大多數抗原也是蛋白質，在水溶液中都具膠體特性，并帶電荷，形成相對穩定的親水膠體。同時抗原、抗體含有羧基、氨基及肽鏈等極性基團，當兩者由于理化特性相吻合互相吸引而結合后，成為憎水膠體系統。抗原和抗體的相互吸引和結合是依靠下列各種分子間引力所促成：
庫侖吸引(yin)力(li)/靜電(dian)引(yin)力(li)，抗(kang)原(yuan)和(he)(he)抗(kang)體分(fen)子相反電(dian)荷的氨基(ji)和(he)(he)羧基(ji)之間相互吸引(yin)而促成；
范德華(hua)引力(li)，由于抗原(yuan)和(he)抗體(ti)分子的(de)外層電子之(zhi)間相(xiang)互作(zuo)用(yong)的(de)擾動產生(sheng)一(yi)種引力(li)，引起分子吸引而發生(sheng)結合，這(zhe)種作(zuo)用(yong)取決于分子的(de)空間構型；
氫鍵結合作用，具-OH、-NH2、-COOH等親水基團的抗體和相應的抗原接近時，可形成相對微弱和可逆的氫鍵橋梁，使得抗原抗體結合；
疏水作(zuo)用，抗(kang)原(yuan)抗(kang)體分(fen)子(zi)側鏈(lian)上的某些(xie)氨(an)基酸(suan)(suan)（如亮氨(an)酸(suan)(suan)、頡氨(an)酸(suan)(suan)及苯丙氨(an)酸(suan)(suan)等）為疏水基團，當抗(kang)原(yuan)抗(kang)體分(fen)子(zi)表面(mian)上的這些(xie)疏水基團密(mi)切接觸時(shi)可(ke)排除(chu)水分(fen)子(zi)，在兩(liang)者之間產(chan)生相互吸引力而發生結合。
1.3.3抗原抗體(ti)的結合具有：
特異性：取決于抗原決定簇的數量、性質和立體構型；抗體Fab段的高變區和相應抗原決定簇的結合能力. 所以抗原抗體的種類質量直接影響結果
可逆行: 結合僅是分子表面的結合,而非共價鍵的結合,具有相對穩定性但為可逆反應.一定條件下（低PH、冬融、高濃度鹽等）所以緩沖液很重要
zui適比例性：兩者量需具一定的量比關系才發生zui強的結合反應。所以抗原抗體的數量也是重要因素
反應具(ju)階段性：受(shou)環(huan)境中電解質、溫度、PH、等因素(su)的影(ying)響。所(suo)以在(zai)ELISA實驗時各種(zhong)步驟一定要(yao)準確到(dao)位(wei)。
1.3.4以氯霉素為例：
酶(mei)(mei)(mei)(mei)標(biao)板(ban)包被針(zhen)對兔IgG（氯(lv)(lv)(lv)霉(mei)素抗體(ti)(ti)）的(de)(de)羊抗體(ti)(ti)。加入氯(lv)(lv)(lv)霉(mei)素抗體(ti)(ti)，氯(lv)(lv)(lv)霉(mei)素酶(mei)(mei)(mei)(mei)標(biao)記物，氯(lv)(lv)(lv)霉(mei)素標(biao)準液或樣品(pin)溶液。游離氯(lv)(lv)(lv)霉(mei)素與氯(lv)(lv)(lv)霉(mei)素酶(mei)(mei)(mei)(mei)標(biao)記物競爭(zheng)氯(lv)(lv)(lv)霉(mei)素抗體(ti)(ti)結合(he)(he)位點，同(tong)時氯(lv)(lv)(lv)霉(mei)素抗體(ti)(ti)也與固(gu)定的(de)(de)羊抗體(ti)(ti)結合(he)(he)。沒有結合(he)(he)的(de)(de)氯(lv)(lv)(lv)霉(mei)素酶(mei)(mei)(mei)(mei)標(biao)記物在(zai)洗滌(di)步(bu)驟中被除(chu)去。將酶(mei)(mei)(mei)(mei)基質(zhi)和(he)發色(se)劑加到(dao)板(ban)孔(kong)中并孵育。結合(he)(he)的(de)(de)氯(lv)(lv)(lv)霉(mei)素酶(mei)(mei)(mei)(mei)標(biao)記物將無色(se)的(de)(de)發色(se)劑轉化(hua)為藍色(se)產物。加終止液后使顏色由藍變黃。用450nm判讀，吸光度值與樣品(pin)中氯(lv)霉素含(han)量成反比。 大多數試(shi)劑盒包被(bei)的是(shi)二(er)抗。
RONDOX的試(shi)劑(ji)盒(he)是直(zhi)接(jie)將氯(lv)霉素(su)特異性抗體預包被酶標板上，當在酶標孔中(zhong)加入樣品和(he)酶標記氯(lv)霉素(su)后(hou)(hou)，樣品中(zhong)的氯(lv)霉素(su)和(he)酶標記氯(lv)霉素(su)競爭抗體結(jie)合位點，洗滌后(hou)(hou)底物顯色，加(jia)酸終止之后，顏色由藍(lan)變(bian)黃。用450nm判讀，顏色深度與樣品中氯霉(mei)素含量(liang)成反比。
不(bu)同(tong)的ELISA原理直接影(ying)響其檢測下限、特(te)異性及結果的計(ji)算(suan)。
1.4 樣品的前處理
不(bu)同樣(yang)品有(you)其(qi)特定的前處(chu)理方法，主(zhu)要有(you)以下幾(ji)種：
1.4.1有機物(wu)抽提(ti)法：（氯霉素）
利(li)用藥物在有機物中的溶解性，達到分離(li)純化的目的
樣品均質 稱量 乙晴和或乙酸乙酯抽提 離心 吹干
異辛(xin)烷/氯仿或正己烷抽提 離心(xin) 取水相分析
1.4.2離子(zi)交(jiao)換法（如：C18過柱法）（鏈霉素）
離子(zi)交(jiao)換是利用(yong)一些帶離子(zi)基團的(de)(de)物質(zhi)，吸附交(jiao)換帶相(xiang)反電荷的(de)(de)蛋白(bai)質(zhi)，將蛋白(bai)質(zhi)按(an)所(suo)帶電荷不同或量的(de)(de)差(cha)異(yi)分(fen)成不同的(de)(de)組分(fen)。
樣品稱量 溶解 上柱
C18柱平衡 洗柱 吸柱(zhu)干(gan)燥(zao) 洗(xi)提(ti) 吹干
緩沖液重懸(xuan) 分析
1.4.3（免疫(yi)）親(qin)和層析（雌激素(su)）
利用(yong)生(sheng)物(wu)大分子的(de)生(sheng)物(wu)學(xue)特(te)性而設計的(de)層析分離技(ji)術，如利用(yong)抗(kang)原和抗(kang)體、酶和酶的(de)抑制物(wu)或配體、激素和受體等(deng)之(zhi)間的(de)親和力，在一定條件下，兩者可(ke)(ke)(ke)緊密結(jie)合形成復合物(wu)，若將其中一者固定在載(zai)體上(shang)，則可(ke)(ke)(ke)從(cong)溶液中提取(qu)和分離相應(ying)的(de)另一方(fang)，并(bing)達到很高的(de)純度(du)。現有商品化生(sheng)產，（方(fang)便，減(jian)少裝柱等(deng)繁瑣步驟）其操(cao)作(zuo)步驟與上(shang)者相似，可(ke)(ke)(ke)以按照(zhao)試劑盒提供的(de)步驟進行。
1.5酶標免疫分(fen)析程序（室(shi)溫(wen)20-240C條件下操作(zuo)）
每一個(ge)盒(he)(he)中的試劑足夠進(jin)行96個(ge)測量(liang)（包括(kuo)標準(zhun)測定孔(kong)），以(yi)E-D CAP檢測試劑盒(he)(he)為例：
1）取出試劑盒(he)恢復至室(shi)溫，充分混(hun)均；
2）釋緩沖液（以(yi)ddw）稀釋備用(yong)（也可用(yong)磷酸鹽緩沖液，但要）；
3）洗緩沖液（以ddw）稀釋(shi)備用，也(ye)可用PBST（磷酸(suan)鹽土溫—20緩沖液）；
4）酶(mei)標記物的配制：按試劑盒說(shuo)明配置、混均，2-8度陰暗處保存；
5）抗體的(de)配制：按試劑盒說明(ming)配置(zhi)、混均，2-8度陰(yin)暗處(chu)保(bao)存；
6）取足夠的微空條，記錄加樣順(shun)序(xu)；
7）a．吸取100微升稀釋緩沖液A1、A2（試劑空白），
b．吸取50微(wei)升稀釋緩沖液到B1、B2（零標(biao)準），
c．吸取(qu)50微升(sheng)標(biao)準液到(dao)C—H孔，
d．加50微(wei)升樣品到其余孔；
8）加酶標記(ji)物和抗體到除(chu)A1、A2的(de)所(suo)有孔；
10）蓋膜，震蕩1分鐘；
11）在一定條件下孵育；
12）洗(xi)板，一定要(yao)*充分，并(bing)且(qie)次數固定，推薦用洗(xi)板機（百樂）；
13）加底物(wu)，室(shi)溫培養(yang)（25度）孵育(yu)；
14）加(jia)終止液；
15）450nm波長下讀數(shu)。
1.6標(biao)準曲(qu)線的繪制
a．每個標準液或(huo)樣(yang)品(pin)的OD值均要減去空白A1、A2的OD值，
b．標準液(ye)和樣品(pin)的(de)OD值除以零(ling)標準（B1、B2）的(de)OD值(zhi)
c． 繪制半對數(shu)曲線（以(yi)B/B0為Y軸(zhou)，標準樣品濃度的(de)對(dui)數為(wei)X軸），可(ke)用(yong)一(yi)些專業(ye)軟件，也可(ke)用(yong)半對數紙(zhi)或(huo)在EXCEL上(shang)繪制。
2、CharmⅡ檢測
CHARM II 6600/7600分析儀是一(yi)臺多功能(neng)、單樣品的液體閃爍（LSC）和生物(wu)發光(guang)計數器。該法(fa)具有(you)快速(su)、簡便(bian)的特點，但其假陽性率教高，適宜(yi)快速(su)篩選
2.1儀器組成：
Charm II 6600 / 7600分析儀(yi)
Charm孵育(yu)器
CentraCL2離心機
均質器(qi)、移液器(qi)
2.2 檢測原理
微生物受體(ti)免(mian)(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)法，屬于免(mian)(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)法的(de)一種，其(qi)建立的(de)基(ji)礎(chu)是藥物功能團與(yu)微生物受體(ti)位(wei)點的(de)結(jie)合(he)反應。在某些(xie)方(fang)面類似于放(fang)射免(mian)(mian)疫(yi)分(fen)析(xi)（RIA），所(suo)不同的(de)是RIA使用(yong)抗體(ti)作(zuo)為結(jie)合(he)劑，而受體(ti)分(fen)析(xi)則是使用(yong)細菌細胞的(de)固定(ding)位(wei)點當做特殊(shu)的(de)結(jie)合(he)劑。
一個單一的(de)細菌細胞(bao)含有可結合藥物(wu)(wu)的(de)特殊結合位點(dian)，藥物(wu)(wu)和(he)受體位點(dian)的(de)結合反(fan)應離解常(chang)數低，因而具(ju)特異性(xing)(xing)和(he)靈敏性(xing)(xing)。對(dui)于該法具(ju)體原理Charm公司未有詳細(xi)深入(ru)的(de)(de)報道（商(shang)業方面考慮），主要是利(li)用兩種不同的(de)(de)細(xi)菌(jun)提(ti)供7大類抗(kang)生素結合的(de)(de)必須位點，藥(yao)物的(de)(de)功能團與位點有關(guan)，不象免疫分析只(zhi)涉及到側(ce)鏈，一種微生物受體可(ke)結合一類藥(yao)物的(de)(de)所有藥(yao)物。
象ELISA類(lei)似，這種結合(he)也是一種競爭(zheng)結合(he)。在(zai)試管(guan)中加(jia)入一定量(liang)的(de)細菌（受(shou)體(ti)）、放射性標記(ji)藥(yao)(yao)物和樣品，樣品中的(de)藥(yao)(yao)物和放射性標記(ji)藥(yao)(yao)物競爭(zheng)結合(he)受(shou)體(ti)，未于受(shou)體(ti)位點(dian)結合(he)的(de)標記(ji)性藥(yao)(yao)物在(zai)讀數前被去掉(diao)，加(jia)入閃爍液，在(zai)分析儀上讀數。
2.3檢(jian)測的一般程序
2.3.1準(zhun)備工作：首先按(an)說明(ming)書(shu)配制好所需(xu)的提(ti)取緩沖液、M2緩(huan)沖液、陰性對照和(he)陽性對照。
儀器零(ling)點測定(ding)：用空試管測(ce)定儀器的零點(dian)是否正常。
試劑和儀器有(you)效(xiao)性(xing)確認：檢測陰性(xing)對(dui)照液和陽性(xing)對(dui)照液各3次，求(qiu)出cpm值(zhi)的平均值(zhi)，與出廠的計(ji)數(shu)單對比，能在(zai)其±10%左右波(bo)動。如果與計數(shu)單相比(bi)偏移較大，試劑可能部分(fen)失效，但只要陽性平(ping)均值/陰(yin)性平均(jun)值小于0.7，試劑仍然可(ke)用，但(dan)靈(ling)敏(min)度(du)會(hui)有(you)所降(jiang)低。
控制(zhi)點(dian)(dian)的確定：控制(zhi)點(dian)(dian)是陰性結(jie)果與(yu)陽性結(jie)果的臨界值(zhi)。利用控制(zhi)點(dian)(dian)來判斷結(jie)果。有兩種確定控制(zhi)點(dian)(dian)的方法：根據樣品的(de)種類或檢(jian)測(ce)水(shui)平選(xuan)擇適當的(de)控制點確(que)定(ding)方法(fa)。控制點確(que)定(ding)方法(fa)有二(er)(er)。有些說明書上兩種方法(fa)都列出(chu)，用戶(hu)可(ke)根據需要(yao)選(xuan)擇，選(xuan)第二(er)(er)種。
方法一(yi)：直(zhi)接以陰性對照來確定(ding)控制點，一般樣品干擾小或接(jie)近儀器(qi)的(de)下*，采(cai)用這種方法，只需再(zai)做3次，與前3次試劑(ji)性能確認的結果一起求平均(jun)值，然后(hou)減法X%，即為控制點。X為變數，由廠家用(yong)定量方法(fa)校(xiao)準。
方(fang)法二：以空(kong)白加(jia)標(biao)樣品(pin)來(lai)確定控制點。這種方法的關鍵是找到陰性樣品(pin)，如果沒有其它的定量方法找陰性樣品(pin)，可根據陰性對照平均值(zhi)來(lai)找陰性樣品(pin)（陰性對照平均值(zhi)±X%）。用此陰性樣品(pin)(pin)，按檢測(ce)水平(ping)和稀釋倍數，加抗生素標(biao)準品(pin)(pin)，用此空白(bai)加標(biao)樣品(pin)(pin)，測(ce)定6次CPM值，求(qiu)平均(jun)值，控制(zhi)點(dian)＝平均(jun)值＊（1＋20%）。
2.3.2測(ce)定實際樣(yang)品
前(qian)處理：不同的樣品(pin)具不同的前(qian)處理方法，一(yi)般尿(niao)樣、血清(qing)、血漿(jiang)等只需(xu)用緩沖液稀釋即(ji)可，而(er)組織樣品(pin)則需(xu)均質、提(ti)取(qu)、孵育等過程，對(dui)于蜂(feng)蜜等一(yi)些樣品(pin)則要過柱。總的來說，前(qian)處理要比ELISA更簡便、快速。
按照操作說明檢測結(jie)合試劑片加(jia)(jia)(jia)入試管；加(jia)(jia)(jia)入300微(wei)升(sheng)水混(hun)(hun)均(jun)；加(jia)(jia)(jia)入處(chu)理(li)過的樣品；加(jia)(jia)(jia)入標記性藥物，混(hun)(hun)合；孵育；離心(xin)，棄去上清液；加(jia)(jia)(jia)水混(hun)(hun)均(jun)；加(jia)(jia)(jia)閃爍液，混(hun)(hun)均(jun)；讀數。
三、實驗室分析(xi)質量控制
涉及儀器的(de)校正、過程控(kong)制、標(biao)準物控(kong)制、環境(jing)、實驗室管理（監控(kong)所進(jin)行的(de)測試及記錄結果，以便發現發展趨(qu)勢，統計技術進(jin)行結果評審）
1、快速(su)篩選方法及定性方法
選擇性：檢出目(mu)的物質的能力；
靈敏(min)性：樣品中(zhong)檢出這種(zhong)藥物真正陽性結果的比率；
準確性：所(suo)得值和真實值的一(yi)致性，用不確定(ding)度來衡量——重復多(duo)次測(ce)定(ding)值和真實值之差；
檢測限：分析(xi)方法能從(cong)樣(yang)品背景信號中檢測出待(dai)檢物(wu)質的(de)zui低(di)濃度；
重復性：
2、定量方法(fa)的附加要求
回(hui)收(shou)率：
定量限(xian)：分析方法能對樣品中待(dai)檢物質(zhi)進行(xing)定量檢測的zui低濃(nong)度，反映該方法在低濃(nong)度端分析結(jie)果的可靠性；
精密度：對(dui)同(tong)一(yi)樣品重復(fu)測(ce)定，每次測(ce)定值(zhi)和均值(zhi)的(de)接(jie)近程度，主(zhu)要反映隨機誤差；
重(zhong)(zhong)復性：批內重(zhong)(zhong)復、批間(jian)重(zhong)(zhong)復線形范圍：曲線的擬和
